اهداف: اینورتاز آنزیمی است که به صورت گسترده در صنایع مورد استفاده قرار می گیرد. منبع اصلی تولید صنعتی آنزیم اینورتاز مخمر ساکارومایسس سرویزیه است. افزایش پایداری حرارتی در این آنزیم کمک مهمی به افزایش بهره وری در تولید مربوطه خواهد کرد. هدف پژوهش حاضر افزایش پایداری حرارتی پروتئین نوترکیب اینورتاز ساکارومایسس سرویزیه با ایجاد جهش های هدفمند بود. مواد و روش ها: در پژوهش تجربی حاضر، با الگوقراردادن آنزیم اینورتاز باکتری گرمادوست ترماتوگا ماریتیما به منظور افزایش پایداری حرارتی، اسیدآمینه های ترئونین 345 و آسپارژین 349 در ژن پروتئین اینورتاز ساکارومایسس سرویزیه با روش جهش زایی هدفمند با آلانین جایگزین و در مخمر پیکیا پاستوریس همسانه سازی با واکنش زنجیره ای پلیمراز SOEing انجام شد. فعالیت آنزیم های نوترکیب اینورتاز طبیعی و جهش یافته در دماهای مختلف، pHهای مختلف، مدت زمان پایداری و پایداری حرارتی-عملکردی اندازه گیری و نمودار میکائیلیس-منتن رسم شد. یافته ها: پایداری حرارتی-ساختاری آنزیم های طبیعی و جهش یافته اینورتاز در دمای 55º C نشان داد که آنزیم جهش یافته در دمای 55º C نسبت به آنزیم طبیعی پایدرای حرارتی بالاتری داشت. هر دو آنزیم طبیعی و جهش یافته در پایداری عملکردی روند مشابهی را نشان دادند. کاهش Km و افزایش Vmax در سوبسترای ساکاروز و افزایش 5برابری نسبت Kcat/Km در آنزیم جهش یافته دیده شد. نتیجه گیری: جهش های هدفمند اعمال شده هیچ اثر منفی روی میزان تولید و همچنین ترشح پروتئین نوترکیب اینورتاز ندارد و باعث افزایش فعالیت آنزیم می شود. آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی، پایداری ساختاری بالاتری دارد، بدون این که تغییری در پایداری عملکردی آن ایجاد کند.

لاکازها ازجمله پلی فنل اکسیداز ها هستند که توانایی اکسید نمودن تعداد زیادی از ترکیبات فنلیک شامل فنل ها، پلی فنل ها، ترکیبات آروماتیک آمین دار و نیز استخلاف های غیر فنلی با استفاده از اکسیژن مولکولی به عنوان پذیرنده نهایی الکترون را دارند. بنابر این، این آنزیم ها در فرآیند های بیوتکنولوژی نظیر سیستم های تصفیه فاضلاب، زیست سالم سازی خاک آلوده و غیره کاربرد فراوان دارند. نتایج تحقیقات قبلی نشان از افزایش پایداری دمایی آنزیم لاکاز باکتری بومی Bacillus sp. HR03 با استفاده از تکنیک جهش زایی هدفمند (SDM) و نقش اسید آمینهE188 در ناحیه لوپ سطحی بین دومین 1 و2 در مقاومت دمایی آنزیم دارد. هدف از انجام این پژوهش بررسی مقاومت حلالی جهش یافته های اسید آمینه مذکور در حضور حلالهای دی متیل سولفوکساید (DMS) و دی متیل فرمامید (DMF) می باشد. مقایسه پارامتر های سنتیکی از جمله Kcat / Km، ∆ ∆ G‡ و C50 نشان از افزایش پایداری آنزیم های جهش یافته نسبت به آنزیم وحشی داشته که کاربرد صنعتی چنین آنزیم هایی را سهل تر می نماید.

در صنعت از آنزیم گزایلوزیداز باکتری سلنوموناس رومینانتیوم (SXA) برای تجزیه گزایلان کمپلکس دیواره سلولی استفاده می شود. مهمترین کاربرد صنعتی این آنزیم، تجزیه دیواره سلولی بافیمانده های گیاهی برای تولید سوخت زیستی (Bioethanol) می باشد. یکی از مشکلات صنعتی در استفاده از SXA، پایداری حرارتی نسبتاً پایین آن در دماهای بیش از ° C 50 می باشد. هر زیرواحد این آنزیم هموتترامر دارای 4 آمینو اسید سیستئین آزاد می باشد. به نظر می رسد که سیستئین آزاد 286 نقثی در فعالیت آنزیمی ندارد. برای بررسی اثر سیستئین آزاد بر پایداری حرارتی SXA، این آمینو اسید با جهش زایی هدفمند به والین تبدیل گردید. جهش یافته مورد نظر سپس وارد مخمر پیکیا پاستوریس گردید و پارامترهای کینتیکی و پایداری حرارتی گزایلوزیداز جهش یافته با تیپ وحشی مورد مقایسه قرار گرفت. درحالی که دمای بهینه، pH بهینه و کارآیی کاتالایتیکی آنزیم جهش یافته تاحدود زیادی شبیه تیپ وحشی بود، نیمه عمر SXA جهش یافته در دمای ° C 55 حدود 65% بیشتر از آنزیم طبیعی به دست آمد (نیمه عمر SXA جهش یافته در دمای ° C 55 حدود 14 دقیقه تعیین گردید در حالی که در مورد آنزیم طبیعی حدود 5/8 دقیقه می باشد). نتایج این تحقیق نشان داد که حذف سیستئین آزاد موجود در بخش های درونی و آب گریز SXA منجر به افزایش میان کنش های آب گریز بین زنجیره های جانبی آمینو اسیدهای مجاور آن می گردد که در نهایت سبب بهبود پایداری حرارتی آن می شود که می تواند برای کاربردهای این آنزیم در زیست فناوری بسیار مهم باشد.

پروتئین CD80 به عنوان عضوی از ابرخانواده ایمنوگلوبولین ها، یک پروتئین تراغشایی است که در سطح سلول های ارایه کننده آنتی ژن (APC) بیان می شود. این پروتئین دارای دو گیرنده CTLA-4 و CD28 در سطح سلول های T است. بر اثر اتصال این پروتئین به این گیرنده ها به ترتیب مسیر مهاری و تحریکی در سلول های T آغاز می شود. در حالت طبیعی، پروتئین های CD80 دارای تمایل اتصال بیشتری به CTLA-4 نسبت به CD28 هستند و این از عوامل خاموش کننده سلول های T در سیستم ایمنی، به منظور جلوگیری از خودایمنی است. هدف از مطالعه حاضر، ایجاد واریانتی از پروتئین CD80 است که دارای تمایل اتصال افزایش یافته به CD28 است تا با قدرت بیشتری به این گیرنده متصل شود و مسیرهای تحریکی را بیشتر از نوع وحشی این پروتئین (پروتئین CD80 اولیه) در سلول های T القا کند. برای شناسایی این واریانت ابتدا توالی وحشی با کمک محیط برنامه نویسی R، در جایگاه های 31 و 92 با اسیدهای آمینه ای که نقش مهمی در شکل گیری پیوندهای هیدروژنی دارند، جهش داده شد. 100 توالی خروجی نرم افزار R، با سرور SWISS-MODEL مدل سازی شدند. سپس مدل های خروجی، به صورت تک تک با سرور HADDOCK داک شدند و در نهایت انرژی های اتصالی از جمله انرژی های الکترواستاتیک و واندروالسی بین گیرنده ها و لیگاندها محاسبه شدند. بین تمامی مدل های ساخته شده، توالی جهش یافته K31Y, R92F دارای بهترین انرژی الکترواستاتیک و واندروالسی است و در مقایسه با نوع وحشی پروتئین CD80، با قدرت بالاتری به پروتئین CD28 متصل می شود.

در آنزیم α-آمیلاز (BAA)B. amyloliquefaciens، رزیدیوهای 185 – 177 (ناحیه I یا لوپ) سازنده بخشی از محفظه (Cage) مسئول اتصال به کلسیم هستند. لوپ موجود در BAA دارای دو رزیدیو بیشتر از همتای ترموفیل خود یعنی α-آمیلاز (BLA) B. licheniformis می باشد و رزیدیوی Arg176 موجود در این بخش با Glu126 از ناحیه II (رزیدیوهای 131 – 118) ایجاد یک پل نمکی می کند که این ارتباط در آنزیم BLA به واسطه جایگزینی های R176Q، E126V حذف گردیده است و از سویی پایداری حرارتی آنزیم BAA به میزان زیادی به یون کلسیم وابسته است. در این تحقیق، اثر پل نمکی در پایداری حرارتی آنزیم بررسی گردید و برای مشخص شدن اهمیت ساختاری و عملکردی پل نمکی مذکور، ابتدا مدل مولکولی آنزیم Δ E126 به طریقه تئوری ساخته شد و در ادامه موقعیت و اثرات رزیدیوهای دو منطقه I و II از طریق برنامه های GETAREA و WHAT IF مورد بررسی قرار گرفت و سپس جهش فوق به وسیله جهش زایی هدفمند در ژن BAA ایجاد شد و پایداری حرارتی آنزیم جهش یافته و وحشی با یکدیگر مقایسه گردید. نتایج حاصل از مدل مولکولی نشان داد که حذف پل نمکی از طریق اثر بر رزیدیوهای آبدوست و آبگریز موجود در دو منطقه I و II باعث افزایش نفوذ پذیری آنزیم به آب می گردد ونا پایداری حرارتی آنزیم جهش یافته نیز نتایج فوق را تایید کرد. بنابراین وجود پل نمکی از طریق کاهش نفوذپذیری آنزیم به آب، مانع خروج کلسیم و غیرفعال شدن حرارتی آنزیم می گردد.

فیتازها آنزیم هایی هستند که اسید فیتیک دانه های گیاهی را هیدرولیز و فسفات را برای حیوانات قابل دسترس می کنند. این امر باعث می شود تا فیتاز به عنوان افزودنی جیره غذایی دام، طیور و ماهیان کاربری فراوانی داشته باشد. افزودن فیتاز به جیره غذایی باعث حفاظت محیط زیست و ممانعت از اثرات زیان بار افزودن فسفر معدنی و پدیده Eutrophication می شود. کاربری وسیع فیتاز در علوم کشاورزی، دامداری و داروسازی نشان از اهمیت تولید طبیعی و نوترکیب فیتاز است. از آنجائی که افزودنی جیره غذایی تحت دمای 70 تا 80 درجه سانتی گراد مرحلهFood Pelleting قرار می گیرد، لذا دستیابی به فیتاز پایدار در برابر حرارت هدف ایده ال است که با استفاده از روش های مهندسی پروتئین می توان به این هدف دست یافت. در این تحقیق پس از بررسی های بیوانفورماتیکی، ژن فیتاز سنتتیکBac phy-Wild مطابق ترجیح کدونی میزبان طراحی و درون باکتری میزبان Escherichia coli-DH5α کلون سازی شد. جهش زایی هدفمند با هدف افزایش پیوند های هیدروفوبی در جایگاه (S392W) انجام شد. ژن طبیعی و جهش یافته Bac Phy-Mut به ناقل بیانی pET26b(+) انتقال یافته و سازه حاصل به درون Escherichia coli-BL21 منتقل شد. نتایج الکتروفروز عمودی حضور خارج سلولی فیتاز با وزن مولکولی 42 کیلو دالتون را نشان داد. هم چنین بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی فیتاز های نوترکیب نشان داد که دمای بهینه 55 درجه سانتی گراد و pH بهینه 5 می باشد. مقایسه پایداری دمایی نمونه جهش یافته نسبت به نمونه طبیعی در دماهای40، 50، 60، 70 و 80 درجه سانتی گراد به ترتیب 18، 24، 19، 9 و 6 درصد بهبود را نشان داد. نتایج مطالعه نشان داد که با استفاده از روش جهش زایی هدفمند می توان از فیتاز جهش یافته پایدار در برابر حرارت با کاربری در صنایع کشاورزی، دامپروری و محیط زیست به عنوان افزودنی جیره غذایی دام، طیور و ماهیان و هم چنین مصارف دارویی بهره برد.